熒光顯微鏡壓汞燈發出的光經集光器聚光后觀察標本
熒光顯微鏡壓汞燈發出的光經集光器聚光后通過激發濾色鏡(有時還有副激發濾色鏡),只有藍光、紫光及紫外光得以通過,經分向鏡將光反射后進入鏡筒,向下通過物鏡而照射用熒光染料處理過的標本,激發出藍色或綠色的熒光沿光軸向上發射,通過分向鏡及阻隔濾色鏡(有時還有副阻隔濾色鏡)及目鏡而成像。此刻有害的紫外光已被全部濾去,視野中所見只是暗視場襯托出的光亮而清晰的物像;根據需要也可讓鏡座上燈室發出的可見光通過而產生亮視野,以顯示發出熒光的目標所在的部位特征。由于熒光染料在光照下極易衰減(褪色),故觀察及攝影需抓緊時間;除攝影外,不應使用強光,可由滑動進光門調節;另外,熒光顯微鏡應在暗室內工作,而熒光染料母液(保存在冰箱冷藏室內)及工作液均應裹以鋁箔遮光。
不同的熒光染料吸收光譜不同,故應針對不同染料選用透光性能不同的激發濾色鏡、分向鏡和阻隔濾色鏡。
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