顯微鏡油浸物鏡觀察免疫熒光時用甘油來代替浸鏡油
顯微鏡觀察和照像
特異性的熒光所發射的光線比起照明所需的總光度來說是較為
暗淡的。因此，由像汞弧高真空燈泡所發出的那種高強度光線對于
獲得明亮的免疫熒光來說是一個較為起碼的要求．
雖然熒光素和繞丹寧強烈吸收300 nm以下的光線，但由于光學
系統很難將光線聚集在這一范圍內而無法作為常規使用．對于這兩
種熒光色索來說，第二個較大吸．收峰太接近于發射峰：在熒光顯
微鏡下觀察是靈敏的，因為所發射的光線是在黑暗的背景中觀察的
。為了這一目的，重要的是只能見到發射的熒光而不能見到照明的
光線。由于只有部分的照明光線被吸收，因而必須把未被吸收掉的
部分與發射的熒光分離開來．如果照明光線和發射的熒光的峰值很
接近，那么就無法將它們分開．因而，當用熒光素和繞丹寧進行免
疫熒光檢查時常常使用近紫外區和短波藍色的光線來作為照明光線
．在這樣的波長范圍內，熒光素和繞丹寧二者都吸收，盡管不像用
較短的或較長波長的光線時那樣有效。在照明光線和樣品之間所使
用的濾光片提供了這一波長范圍并使得組織所產生的自身熒光減到
較小。
次級濾光片放在樣品和目鏡之間以保留發出的熒光光線而截斷
任何的激發光線。因此，次級濾光片應該能夠將通過初級濾光片的
光線都阻斷在使用雙重染色技術時，需要將較弱的繞丹寧熒光與熒
光素的強熒光進行對比，
因此較好是同時激發兩個波長的光線而不只是一個，這樣就能夠
獨立地改變對于熒光素較適合的激發光和對乎繞丹寧較適合的激發
光線的強度。
射出的熒光。然而，暗視野照明卻大大簡化了對于濾光片的選擇，
因為即使不用濾光片也保證大部分的照明光線不能夠達到目鏡，而
只能看到熒光發射出來的光線。在實踐中，暗視野聚光器通常是與
濾光片一同使用的。在油浸物鏡下觀察免疫熒光時用甘油來代替浸
鏡油。
照像是必需的，因標本在貯存過程中會褪掉熒光。熒光強度的
這種減弱對于照像技術本身也是一個重要的因素：在做暗視野顯微鏡
觀察時總光線強度常很低，特別是當只有切片的一小部分發射熒
光時。因此，曝光時間就趨于很長。然而，在進行長時間曝光的過
程中，熒光強度本身亦逐漸消褪。故應嘗試用較可能短的曝光時問
；因此，有人便推薦了具有高ASA等級的底片。除此之外，還需要
一個非常標準化的自動曝光表，因為光線的測量與曝光是同步的，
而在進行曝光期間熒光的任何減低都會自動地得到補償．
在進行照像的樣品經過繞丹寧和FITC結合的抗體雙重染色時，
重要的是要理解熒光素的熒光比繞丹寧熒光的壽命要短。在試圖保
持FITC熒光方面，相當普遍的做法是在對組織進行細致的觀察之前
先照下像來。當照像之后再觀察組織時，大部分的染色可能已消失
，因面觀測的結果不得不全然依靠暗視野照片．
