研究過程與方法
實驗首先利用免疫染色法了解細胞內胞器的分布情形。免疫染色是利用抗原及抗體之間的專一結合特性,使抗體跟抗原結合,若將螢光物質標定在抗體上,即可以利用螢光顯微鏡觀察抗原所在的位置。配合其他已知的標定分子(如DNA位在細胞核,Golgin-245蛋白質位在高基氏體)我們可順利觀察實驗中蛋白質所在的胞器位置,探討蛋白質在細胞內的運輸情形。
實驗是以螢光標定的霍亂毒素次單元B(CTB-594nm)及運鐵蛋白質(Tf-488nm),了解細胞外的分子是透過內胞作用由細胞膜運送到高基氏體。此二種蛋白質的不同之處是運鐵蛋白質的胞飲作用需透過包涵素外衣囊袋(clathrin)的三角架結構運送,而霍亂毒素次單元則大都不需透過包涵素外衣囊袋運送。實驗過程中,直接加入螢光標定的霍亂毒素次單元B及運鐵蛋白質,皆會受細胞自動胞飲進入細胞,我們只需控制蛋白質運輸過程的時間即可觀察到這些蛋白質會被運送到所預期的標的地(例如:endosome、Golgi、ER)。
實驗是利用細胞轉染的方法,將外源基因送至細胞中,使細胞表現該基因。常用的細胞轉染法有【磷酸鈣】、【電穿孔法】、【脂小體】和【顯微注射】等。此次實驗是以脂小體為媒介將ARL1的突變株ARL1QL及VSVG-GFP轉染到細胞內。將VSVG-GFP質體轉至細胞內則該外生性VSVG-GFP會運送至高基氏體后,再運送到細胞膜,因此透過VSVG-GFP這種毒蛋白質可以了解外釋作用。而我們同時送入的是一種會參與調控囊泡運輸的特殊蛋白質分子ARL1QL,觀察ARL1QL對于VSVG-GFP運輸過程的調節作用。